脂肪性肝病，包括非酒精性脂肪性肝 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD) 和非酒精性脂肪性肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH)，与肠道屏障通透性增加和细菌或细菌产物进入血液循环的移位有关。
在本研究中，研究者的目的是阐明肠道屏障完整性和肠道菌群在NAFLD/ NASH发生发展过程中的作用。用高脂饮食(HFD)或蛋氨酸-胆碱缺乏饮食喂养C57BL/6J小鼠1周或更长时间，以模拟NASH的各个方面(脂肪变性、炎症、胰岛素抵抗)。
① 该研究发现肠上皮屏障和肠血管屏障(gut vascular barrier, GVB)的破坏是NASH发病的早期事件。喂食HFD仅1周的小鼠经历了由饮食引起的菌群失调，这种失调会导致GVB损伤和细菌移位进入肝脏。将HFD喂养的小鼠的粪便微生物移植到特定的无病原体受体小鼠中会导致GVB损伤和附睾脂肪组织增加。
② GVB干扰依赖于对Wnt/β-catenin信号通路的干扰，如基因干预仅在内皮细胞中驱动β-catenin(β-连环蛋白)激活，从而阻止GVB的破坏和NASH的发展。胆汁酸类似物和法尼醇X受体激动剂奥贝胆酸(obeticholic acid, OCA)驱动内皮细胞中β-catenin的激活。因此，OCA的干预可以防止GVB破坏，既可以作为预防手段，也可以作为治疗药物。
③ 更为重要的是，研究者发现NASH患者结肠中GVB渗漏的标志物上调。
总之，本实验中研究者首次发现了NASH发展中的一个新参与者，GVB，其损伤可导致细菌或细菌产物进入血液循环。以恢复内皮细胞β-catenin激活为目的的治疗方法，如OCA的使用，可减轻GVB的损伤和阻止NASH的进展。
论文ID
原名：Microbiota-driven gut vascular barrier disruption is a prerequisite for non-alcoholic steatohepatitis development
译名：肠道菌群驱动的肠道血管屏障破坏是非酒精性脂肪肝炎发展的先决条件期刊：Journal of HepatologyIF：18.946
发表时间：2019.12通讯作者：Maria Rescigno作者单位：意大利人文大学生物医学科学系
1 肠上皮和血管屏障破坏是高脂肪饮食暴露中的早期变化HFD是一种富含动物饱和脂肪(45%猪油)的饮食，研究表明在C57BL/6小鼠中HFD可以诱发致胰岛素抵抗、II型糖尿病和NASH的代谢紊乱。研究者首先评估HFD与对照饮食相比，是否可以改变IEB和GVB。作为上皮损伤的标志，在喂养后的早期时间点(48h)分析了紧密连接蛋白ZO-1在HFD小鼠回肠和盲肠固有层中的表达和细菌易位，并与对照组C57BL/6雄性小鼠进行了比较。如图1A-C所示，在48小时，发现HFD上皮细胞的紧密连接蛋白ZO-1的表达降低(图1A，B)。HFD中肠上皮细胞相关ZO-1(蓝线)的平均荧光强度比对照喂养的小鼠显著降低(图1A，B，剖面图)，这可能与回肠和盲肠固有层细菌易位增加有关(图1C)。肠血管屏障遭到破坏的标志物是质膜相关蛋白1(plasmalemma vesicle-associated protein 1,PV1)，一种与内皮横膈膜相关的整合膜蛋白，可通过抗体MECA-32进行标记。研究者发现在48小时， PV1的暴露并没有明显增加(图1A，B，红线，剖面图)。然而，在HFD开始后1周，通过盲肠和回肠的共聚焦(图1D)和FACS(图1E)分析进行评估，ZO-1在肠上皮细胞(EpCAM+)和CD34+血管内皮细胞中均下调。此外，在结肠中，尽管与对照组相比没有达到统计学上的显著差异，HFD处理依然导致血管内皮细胞和上皮细胞中ZO-1表达的减少，而其他紧密连接蛋白如occludin，Claudin-3和Claudin-5的表达不受HFD喂养的影响。同时，在HFD喂养的小鼠的回肠和盲肠中发现PV1显著上调(图1F，G)。在空肠和结肠中观察到类似的情况(图1F，G)。图1. 1周的HFD喂养足以引起肠道血管屏障的破坏. A-C小鼠在取肠前，分别用对照组(Ctrl)饮食和HFD喂养48小时。(A)回肠和(B)盲肠切片染色CD34(绿色)，PV1(红色)，ZO-1(渐变)和DAPI(青色)表达，第一行显示合并的图像，第二行仅显示具有梯度的CD34和ZO-1(如图例中所示)，以及指示荧光强度测量位置的虚线，第三行显示每个标记的强度配置文件。测定回肠和盲肠中的CFU，如C中所示，喂养1周的小鼠(D-G)肠道成像为(D)整块或(F)切片。(E)用FACS分析来自盲肠和回肠的细胞悬液中ZO-1的表达。(G)对CD34+区域进行PV1定量。
上述结果表明HFD处理后引发的一系列连续事件：首先是IEB的破坏，导致细菌或其分子决定簇从管腔中移位，以及随后的GVB损伤。因此，我们分析了高负荷的病原体相关分子模式是否可以重现观察到的效果。小鼠灌胃LPS后24小时发现ZO-1表达显著降低，表明IEB遭到损伤；48小时后LPS引起内皮细胞PV1表达增加，且呈剂量依赖性，表明内皮细胞暴露于高浓度LPS时GVB受到了破坏。然后，研究者分析了在HFD喂养的后期，当胰岛素抵抗产生时，GVB是否受到损害，以及这是否与肝脏内炎症反应增加有关。为此，给小鼠喂食含有60%脂肪(60%HFD)的饮食，与45%HFD不同，可以在动物模型中诱导炎症反应。此外，在喂食60%HFD 持续24周的小鼠中，通过回肠和结肠中的PV-1染色进行评估(图2A，B)证明GVB被破坏，这与血液中LPS易位的增加有关(图2C)。NASH的诱导通过肝脏中的脂质堆积 (油红O染色，图2D)，纤维化(胶原纤维的天狼星红染色，图2D)和血清转氨酶升高(ALT，图2e)来证实。小鼠也表现出明显的胰岛素抵抗，通过改变对葡萄糖和胰岛素耐量试验的反应来评估(图2F)。肝脏中观察到明显的炎症迹象，炎性细胞因子和趋化因子(IFN-γ，IL33和CCL2)(图2G)和免疫细胞(CD45+细胞)的增加，特别是CD4+和CD8+T细胞，单核细胞和巨噬细胞(图2H)。上述结果表明，HFD喂养的早期，导致IEB破坏从而引发细菌易位，随后是GVB遭到破坏。GVB的干扰在NASH和炎症驱动的胰岛素抵抗和肥胖症的整个发展过程中保持不变。图2 长期饲喂HFD会导致GVB破坏和肝脏炎症和脂肪变性. A-H小鼠在取肠前，分别用对照组(Ctrl)饮食和HFD喂养24周。(A)回肠和结肠切片进行CD34(绿色)、PV1(红色)和DAPI(蓝色)表达染色. (B)对CD34+区域进行PV1 MFI定量。(C)测定Ctrl或HFD喂养的小鼠血清中LPS水平。(D)肝切片进行H&E，ORO或天狼星红染色分析。(E)Ctrl或HFD喂养的小鼠血清ALT浓度。(F)空腹和腹腔注射葡萄糖(2g/kg小鼠)和胰岛素(0.2IU/kg小鼠)6h后进行葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验。(G)通过qPCR分析Ctrl或HFD喂养的小鼠肝脏中的基因表达。(H)FACS染色Ctrl或HFD喂养的小鼠肝脏中的免疫细胞以绝对数表示。
在发现跨越上皮的细菌易位后，研究者假设如果GVB被破坏，如PV1表达增加所示，在肝脏中也应该检测到细菌。为了检测细菌的存在和位置，我们使用探针进行FISH分析来检测Eubacteria 16S rRNA的区域，并对CD45进行免疫染色来检测淋巴细胞。实验发现，对照组小鼠的肝脏中含有少量的细菌，这些细菌大多位于CD45+免疫细胞内，尽管尚不清楚这些细菌是驻留的肝脏细菌还是从其他地方穿梭过来的(图3A，B)。相反，在喂食HFD的小鼠的肝脏中，在免疫细胞外的薄壁组织中发现了细菌(图3A，B)，这表明它们可以自由迁移到肝脏。与细菌易位增加一致的是，喂食HFD的小鼠血清中的LPS水平始终高于喂食对照饲料的小鼠(图3C)。为了从功能上评估GVB是否被有效破坏，我们进行了荧光内窥镜检查。用HFD或对照饲料喂养小鼠1周，静脉注射类似细菌大小的高分子量FITC-葡聚糖荧光探针(500 KDa)。通过荧光活体内窥镜评估染料向回肠固有层渗出的能力。使用这种方法，研究者确认GVB通透性增加导致了细菌易位(图3A，B)，在HFD喂养的小鼠中，肠道血管对染料具有渗透性(图3D-F)。有趣的是，尽管体重和脂肪组织大小增加，但观察到的GVB和IEB破坏先于肝脏脂肪变性、脂肪细胞扩大或胰腺损伤的任何迹象，例如油红染色或组织学所示(图2)。众所周知，HFD会引起小鼠肠道微生物组成的变化。因此，在观察到IEB和GVB破坏是HFD引起的早期事件后，研究者通过进行粪便微生物移植(FMT)来评估饮食诱导的微生物变化是否是GVB破坏的原因。结果表明，与SPF小鼠相比，成年无菌小鼠表现出更高的PV1表达，这表明微生物可能参与控制GVB。然而，无菌小鼠的微生物重建不会导致PV1正常化，这表明GVB的损害不能被微生物纠正，至少在成年小鼠中是这样。此外，GF小鼠对HFD诱导的NASH具有抵抗力，证实了我们的假设，即肠道细菌易位是导致NASH发展的原因。基于这些原因，研究者对SPF小鼠进行FMT，供体小鼠分别饲喂HFD或对照饲料，1周后收集粪便及相关黏液菌群，转入受体小鼠体内(图3G)。受体小鼠被维持在标准的饲料中，一周后分析体重增加并收集其器官。如图3H所示，与从对照饮食中接受FMT的小鼠相比，接受来自HFD喂养的小鼠的FMT的小鼠即使喂食标准饮食，也显示出更多的附睾脂肪组织。此外，用来自HFD喂养的小鼠的FMT处理的小鼠的GVB显示出增加的PV1表达(图3I，J)。综上所述，这些结果表明HFD修饰了肠道微生物组成，导致了影响GVB的生态失调，并与肠血管通透性增加相关。图3 GVB泄漏导致菌群相关移位. (A)用对照(Ctrl)饲料或HFD喂养A-F小鼠1周，(A)肝脏切片进行菌体(绿色)和非EUB(红色) Fish原位杂交，然后进行CD45(白色)和DAPI(蓝色)染色。侧面图像显示主图像中由正方形划分的放大区域的合并和单独染色。(B)为每只小鼠计数细菌，并测定CD45+细胞内外的细菌百分比。(C) 测定HFD喂养1周小鼠血清中LPS水平。(D-F)1周龄小鼠静脉注射500 kDa FITC-葡聚糖，通过活体探针共聚焦显微镜成像。来自内窥镜视频在指定时间点的代表性照片以C表示。 (E)随时间绘制荧光比率，(F)计算每只小鼠的AUC。 (G)对1周喂养的供体进行粪便微生物移植，1周后对受体进行分析。(H)测定器官和体重，并计算进食重量(占身体的百分比)。(I)盲肠为PV1(红色)，CD34(绿色)和DAPI(蓝色)染色，在CD34+区域(J)上进行PV1的量化。
在雌性C57BL/6小鼠中进行6周的HFD喂养后也获得了类似的结果，这些小鼠也出现延迟的疾病发展和更广泛的糖尿病前期状态(图4A)。同样在这种情况下，小鼠增加了它们的体质量和内脏脂肪组织(图2)。S4B)以及在没有肝脏脂肪变性或胰岛素抵抗的情况下(图4B)。S4C，D)，它们显示肠血管内皮细胞上PV1表达增加，ZO-1表达减少(图2)。S4E)。综上所述，HFD过程中增加的内皮通透性和细菌易位表明GVB破坏是NASH发展的早期事件，通常发生在肝脏脂肪变性之前。在HFD期间观察到GVB的中断后，研究者评估了它在NASH诱导中的作用。我们先前已经证明，干扰内皮细胞中的Wnt/β-catenin信号通路是鼠伤寒沙门氏菌诱导GVB破坏的一种机制。因此，使用VE-cadherin Cre(Cdh5(PAC)-creERT2)小鼠与β-catlox(Ex3)/lox(Ex3)杂交，后者包含β-catenin基因外显子两侧的2个FLOX序列，从而迫使小鼠仅在内皮细胞中激活β-catenin。服用他莫昔芬后，在Cre+小鼠中，β-catenin的第3外显子被删除，导致β-catenin的不可降解形式和功能获得(GOF)表型。当β-连环蛋白被组成性激活时，GVB不能被干扰。使用外显子3的浮动小鼠(b-catlox(Ex3)/lox(Ex3))或Cre-litterate小鼠作为对照，它们来自相同的母系(共享相同的菌群)，具有相似的结果。Cre+和Cre-小鼠喂养对照饲料或HFD 1周，来评估PV1可及性。如图4A，B，HFD不能诱导β-catenin GOF小鼠PV1上调。正如预期的那样，由于GOF只发生在内皮细胞，上皮细胞不受影响，细菌在HFD后仍然可以转移到回肠和盲肠(图4C和数据未显示)。接下来，我们分析了肝脏的细菌移位，发现Cre+ β-catenin GOF小鼠在喂食HFD时与对照组小鼠相似(图4D,E)。在HFD喂养的Cre-小鼠中，可以找到游离的细菌，而不是被CD45+免疫细胞内化，而在Cre+小鼠中检测到的大多数细菌是在免疫细胞内。这表明，在完整的GVB存在下，游离细菌进入肝脏的易位受到阻碍。当小鼠喂食HFD较长时间，以诱导肝脏脂肪变性时，我们观察到CRE+ GOF小鼠没有出现脂肪细胞扩大(图4F，G)，并且完全不受NAFLD的保护，如组织学和肝脏中缺乏脂质积累(图4F)所示。在CRE+ GOF小鼠中，我们还观察到HFD诱导的血糖水平的改善(图2)。有趣的是，HFD喂养10天导致CRE-小鼠脂肪组织中的白细胞募集，包括CD8+T细胞和炎性单核细胞，而不是CRE+ GOF小鼠(图2)。总之，这些结果表明IEB本身的损伤不足以诱导NASH，而GVB干扰也是必需的。图4. 内皮特异性功能增强的小鼠对脂肪变性诱导具有抵抗力. A-E β-catenin获得功能的小鼠用他莫西芬喂养2天诱导重组，然后用Ctrl饮食或HFD喂养1周或(F，G)18周；(A，B)回肠切片分析PV1的表达和(C)确定CFU。(D，E)肝脏切片在CD45(白色)和DAPI(蓝色)染色之前提交真细菌(绿色)和非EUB(红色) Fish原位杂交。侧面图像显示主图像中由正方形划分的放大区域的合并和单独染色。为每只小鼠计数细菌，并(E)测定CD45+细胞内或外的细菌百分比。(F)喂养18周后，如所示，对EAT和肝脏切片进行H&E或ORO染色分析。第一行，肝脏苏木精伊红染色；第二行，肝脏Oro染色；第三行苏木精伊红染色，测量脂肪细胞直径并显示在图G。
4 FXR激动剂奥贝胆酸可以作为保护GVB完整性的治疗药物如上所述，在动物模型和患者中，OCA已被证明可以改善NASH。OCA还通过FXR依赖机制保护炎症诱导的上皮通透性，并减少胆汁淤积和肝硬化大鼠肠系膜淋巴结的细菌移位。因此，我们评估OCA是否可以通过靶向GVB影响HFD诱导的肠道通透性。我们用HFD或对照饲料喂养小鼠，并口服OCA(30 mg/kg，连续1周)。有趣的是，实验观察到OCA抑制PV1的上调(图5A-C)并增加ZO1的表达(图5A-C)，表明GVB的紧密性更强。然后我们问控制PV1表达是否会导致GVB保护。用HFD或对照饲料喂养小鼠1周，加或不加OCA，然后用高分子量(500 KDa)荧光探针FITC-dextran静脉注射。发现，OCA给药减少了染料的外渗，表明OCA在功能上保护GVB免受破坏(图5D-F)。
图5. FXR激活控制GVB紧密性. (A-F)小鼠喂饲Ctrl饲料或HFD 持续1周并补充OCA。(A-C)回肠和盲肠切片分析PV1表达. (D-F)小鼠静脉注射500 kDa FITC-葡聚糖，通过活体探针进行共聚焦显微镜成像. D在指示的时间的内窥镜视频的代表性照片显示. (E)外/内荧光比随时间绘制. (F)计算每只小鼠的AUC。
除了HFD模型导致类似于轻度NASH的代谢紊乱，研究者还测试了MCDD模型，该模型概括了更严重的NASH病理特征。首先评估了MCDD是否可以在GVB中引起扰动。用MCDD或对照饲料喂养小鼠1周，评估回肠中PV1的表达。如图所示，MCDD诱导PV1表达明显上调，OCA可纠正这种上调作用。这些结果表明，MCDD也可诱导GVB损伤，并且OCA在该模型中也具有保护作用。为了评价OCA改善NASH的疗效，我们用MCDD喂养小鼠2周，在肝损伤发生后通过血清中ALT浓度的升高和肝脏中的脂质积累来评估其疗效。然后每天通过口服给予OCA，持续2周，在仍然喂食MCDD的小鼠中(图6A)。发现，MCDD诱导的上调的PV1表达被OCA在回肠和结肠中恢复，表明其能够封闭受损的GVB并防止进一步的MCDD诱导的损伤(图6B，C)。此外，2周的OCA治疗治愈了肝脏损伤，降低了ALT水平和肝脏中的脂质积累(图6D，E)。这些数据提示我们，OCA可能通过FXR激活在通过上皮细胞间接或直接通过对内皮细胞的作用来控制GVB完整性方面发挥作用。事实上，FXR在内皮细胞中表达，调节炎症、血管紧张等功能。由于GVB的完整性受Wnt/b-catenin信号通路的控制，实验评估了OCA是否可以激活该通路。将原代内皮细胞暴露于OCA，评估β-catenin下游靶基因的表达。如图所示，OCA不仅上调了Lef1和Ccdn1β-catenin靶基因，而且上调了紧密连接蛋白Cldn5和Zo-1的编码基因。总之，这些结果表明，OCA可以通过激活Wnt/b-catenin信号通路并上调紧密连接蛋白而直接作用于内皮细胞，从而实现GVB保护和内皮细胞封闭。在证明GVB损伤是NASH发生的前提条件后，我们分析了是否也可以检测到NASH患者肠道中PV1的上调。我们测试了9例NASH患者结肠镜检查期间获得的结肠活检组织中PV1的表达(表2)。作为对照，我们分析了来自肿瘤患者的结肠健康部分。如图6F，G所示，NASH患者肠内皮血管中PV1的表达上调，表明GVB在人类NASH的发病机制中也受到损害。图6. 奥贝胆酸治疗可改善MCDD模型的GVB和肝损伤.(A)小鼠在给予OCA或其载体前喂食饲料或MCDD 2周. (B)回肠和结肠切片进行CD34(绿色)、PV1(红色)、ZO-1(白色)和DAPI(蓝色)表达染色. (C)对CD34+区域进行PV1 MFI定量. (D)测定喂食CHOW或MCDD和OCA处理或不处理的小鼠血清ALT浓度。(E)肝脏切片进行H&E或ORO染色分析. (F)NASH患者的健康组织或结肠进行PV1染色. (G)对两组PV1染色进行定量.
研究者发现，由于GVB紊乱引起的肠道通透性增加可能是导致整个细菌或细菌代谢产物通过门静脉循环转移到肝脏，并最终进入体循环的原因。通过保护GVB，激活内皮细胞中的Wnt/b-catenin信号通路，可以预防NASH及其相关的代谢综合征。这提示我们，GVB可以作为一个新的治疗靶点。然而，由于目前的研究不能仅在肠内皮细胞中控制Wnt/b-catenin信号通路的激活，因此不能排除肝内皮细胞中该通路激活的伴随效应。此外，研究证明，用OCA靶向FXR可以导致内皮细胞中Wnt/b-catenin信号通路的激活和GVB的封闭，从而抑制潜在有害细菌及其相关代谢物的进一步易位，对NASH控制具有明显的影响。这可能有助于解释OCA在NASH患者中的有益作用。同时，深入研究肠道上皮屏障的作用，特别是GVB在其他系统性疾病中的作用，有助于整个肠-肝脑轴的临床研究，并可能为其治疗干预提供新的研究策略。
脂肪性肝病一般要经历一系列的病理状态，从肝脏脂肪堆积(脂肪变性)，到肝细胞变性(膨胀)，炎症(脂肪性肝炎)，最终进展为肝硬化和肝细胞癌。脂肪性肝病可能是长期过量饮酒(酒精性肝病)或内脏肥胖和代谢综合征(不饮酒)的结果，导致非酒精性脂肪肝(NAFLD)，而非酒精性脂肪性肝炎(NASH)可演变为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。几个可能并行作用的因素与NASH的发展有关，包括遗传易感性、表观遗传学改变、胰岛素抵抗、脂质代谢异常、氧化应激、脂毒性、线粒体功能障碍、内质网应激、肝细胞凋亡、肝星状细胞的激活、免疫细胞的激活和募集以及炎性细胞因子的产生、脂肪因子的改变和肠道菌群失调。肠道微生物的重要作用已在临床前NAFLD/NASH模型和NASH患者中明确确立。小肠内细菌过度生长及定性微生物群异常可损害肠粘膜的屏障功能，导致粘膜通透性增强，内毒素随之转移至体循环。肠屏障在肝脏疾病发展中的作用已被确定，但仍有几个问题尚待解决。目前并不清楚肠道通透性增加是否是肝病的原因或结果，特别是在NASH中。该研究较好地将微生物与上皮和肠道血管通透性的增加以及NASH的发展联系起来：
① 该研究发现，肠道血管屏障的破坏是NASH发病机制的早期事件，也是饮食诱导失调的结果。
② 同时，GVB的损害是持续的，因为仍然在NASH的炎症模型中观察到(HFD 60%)。此外，GVB干扰是NASH发展所必需的，而GVB也可以作为药物干预的新靶点。
③ 该研究发现，FXR激动剂OCA可以激活Wnt/β-catenin信号通路，从而封闭GVB。同时，HFD喂养期间给予OCA可以抑制GVB中PV1的上调和随后增加的通透性，并且还能够恢复MCDD模型中PV1的表达。
该研究也为其他肠-肝脑轴的临床研究及干预治疗提供新的研究思路。备注：原文题目为“科研 | Journal of Hepatology：肠道菌群驱动的肠道血管屏障破坏是非酒精性脂肪肝炎发展的先决条件”
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是影响全球上亿人的一个主要健康问题，迄今为止尚无任何获批药物。令人振奋的是，2019年见证了NASH新药发现和开发方面的进步，很可能首个NASH药物将在2020年初获得FDA批准。在这个非常关键的时刻，中国NASH新药联盟和药时代联合，计划在成功举办“2019年NASH新药研发专题研讨会”的基础之上进一步扩大规模，于2020年3月27、28日举办2020中国NASH大会，这将是中国首个聚焦NASH新药研发的国际大会，旨在报道最新进展，探讨高效开发新药的战略和战术，以加快NASH新药的研发上市，最终挽救中国及全球的千万患者。这项活动已得到来自海内外著名专家学者和知名KOL的大力支持，已经引起了业界和专业人士的广泛关注。
中国NASH新药联盟，作为一个聚焦NASH新药研发的非盈利性行业组织，汇聚了研发、医疗、服务、投资、监管、咨询等相关行业的机构和个人，通过分享信息、举办会议、培训等活动促进会员、行业同仁之间的交流、合作以及联盟与监管机构、国外同类组织之间的互动、合作，提升中国NASH新药研发的整体水平，最终推动、加快NASH新药的研发、上市，惠及中国及全球的患者。2020年联盟的线上线下活动将陆续开展，联盟将在23名首批成员单位的基础上进一步扩大规模和影响，为行业和社会做出自己最大的贡献。
我们热烈欢迎朋友们参加！期待与您欢聚上海，共议NASH新药研发之大计！
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